Известно, что фотосинтетический аппарат гидромакрофитив очень чувствителен к воздействию различных факторов окружающей среды и один из первых реагирует на их негативное влияние. В связи с тем, что важнейшими компонентами фотосинтетического аппарата является фотосинтетически активные пигменты, содержание, состояние и активность которых в значительной степени определяют весь комплекс процессов метаболизма организмов, несомненно, что изменения фотосинтетической активности пигментного аппарата могут быть чувствительным показателем общего физиологического состояния растительного организма.
Спектрофотометрическое определение и хроматографическое разделение пигментов высших водных растений
Пигментный комплекс растений участвует в образовании многих специфических веществ, которые в зависимости от условий, могут оказывать ту или иную направленность процессам роста и развития растений. Поэтому, возможность нормального существования водных растений, сохранения единства этого комплекса условиям водной среды, способность организма перестраивать весь ход физиолого-биохимических процессов в соответствии с изменениями этих условий тесно связаны с их пигментным комплексом. В высших водных растений основную функцию фотоассимиляции выполняют хлорофиллы и каротиноиды.
Хлорофилл – хороший показатель физиологического состояния водного растения. Известно, что растения, фотосинтез которых осуществляется в оптимальных условиях, содержат большее количество хлорофилла а чем хлорофилла в. Соотношение этих пигментов в листьях здоровых растений в норме больше 1,0. Изменение соотношения двух основных форм хлорофилла свидетельствует о смещении равновесия в фотосинтетической системе и значительных нарушениях физиологического состояния растений, а снижение этого соотношения до уровня меньше единицы указывает на преобладание процессов деструкции органического вещества над ее продукцией.
Каротиноиды участвуют в процессе фотосинтеза, роста, морфогенеза и размножения и выполняют еще много различных функций в организме. Так как известно, что в гидрофитов сравнению с наземными растениями повышенное содержание каротиноидов – одна из адаптивных реакций растений, обеспечивает более полное поглощение коротковолновой части рассеянной в водной толще лучистой энергии, естественно, что уменьшение общего количества этих пигментов повлияет на весь метаболизм растения.
Для определения концентрации фотосинтетических пигментов водорослей используют различные методы: спектрофотометрический, флуориметрическим и хроматографический. Самые распространенные из них-спектрофотометрический метод, несмотря на свою простоту, позволяет в одной пробе определить различные хлорофиллы, продукты их деградации, а также каротиноиды, и метод тонкослойной хроматографии.
Определение концентрации фотосинтетических пигментов водорослей включает стандартные процедуры: получение навески, измельчения и нейтрализацию материала, экстракцию пигментов растворителем и измерения оптической плотности экстрактов.
1. Получение навески. Когда берут навеску растительного материала необходимо учитывать два важных условия: количество навески и скорость взвешивания. Количество навески зависит от содержания в исследуемом материале пигментов. Так, например, при работе с нормальными зелеными листьями берут навеску 0,4-0,5 г, а для исследования содержания пигментов в лиофильно высушенных хлоропластах достаточно 20 мг.
В некоторых случаях нужно провести сравнительные расчеты содержания пигментов не только на единицу массы, но и на единицу площади поверхности, тогда следует делать высечки сверлом известного диаметра и взвешивать определенное количество висичок.
Скорость взвешивания зависит от материала. Фиксированный сырой или сухой материал можно взвешивать на аналитических весах, поскольку за время взвешивания навески с ней не происходит существенных изменений. Если взвешиванию предшествует фиксация, или растения являются собственно гдрофитамы то навеску нужно делать быстро, пользуясь при этом торзийнимы весами.
2.Подрибнення и нейтрализация материала. Для быстрой и полной экстракции пигментов необходимо хорошо измельчить материал. Свежий материал измельчают в ступке (небольшие навески), или в гомогенизаторе (большие количества) с добавлением в качестве абразивного компонента кварцевого песка, толченого стекла или синтетического алмазного порошка. Для нейтрализации клеточного сока добавляют мел или соду.
3.Екстракция пигментов. Экстракцию пигментов проводят различными способами в зависимости от поставленной цели, характера материала и природы растворителя. Так как пигменты в листьях связаны с липопротеинами, их полную экстракцию можно провести только после возбуждения этого связи. Неполярные растворители не нарушают связь хлорофилла с белком, поэтому для полного извлечения пигментов из сырых листьев надо применять полярные растворители. Чаще всего используют 80%-ный ацетон и 96о-й спирт (этанол или метанол). Чтобы получить прозрачный раствор пигментов следует отделить жидкую фазу от твердой, которая состоит из осадка мезги, абразивного материала и нейтрализующих агентов. Это достигается путем фильтрации под вакуумом с помощью электронасоса или насоса Камовського через фильтр Шотта с пористого стекла или центрифугированием. Полученный фильтрат доводят до метки в мерной посуде.
4.Роздилення пигментов с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках “Silufol”. На пластинку наносят экстракт пигментов. Для получения одномерной хроматограммы не имеет значения ни количество, ни форма пятна, которую наносят. Раствор пигментов наносят пипеткой на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Чтобы ускорить испарение растворителя на пластинку направляют поток воздуха от вентилятора.
Используя различные растворители и их сочетания, на хроматограмме получают любое размещение пятен. Для разгонки пластинку с нанесенной пятном помещают в хроматографическую камеру, на дно которой наливают небольшим слоем (1-1,5 см) отдельные растворители, или их комбинации. Растворитель, поднимаясь вверх по пластинке, влечет пигменты, распределяя их на разных уровнях пластинки.
1.Чистий петролейный эфир удаляет каротин, который движется вместе с фронтом растворителя.
1.Сумиш петролейного эфира с бензолом (1:3) удаляет из пятна все пигменты в такой последовательности: с самого верха – каротин с фронтом растворителя, ниже лютеин, виолоксантин, смесь хлорофиллов (хлорофилл а и в не разделяются друг от друга – выше размещен хлорофилл а, ниже хлорофилл в), под хлорофиллом в розищений ксантофил-неоксантин, который немного замаскированный хлорофиллом в.
2.Подибну универсальную действием обладает смесь гексан-ацетон-метанол (15:5:0,5).
3.Чистий петролейный эфир и смесь, состоящая из бензина-бензола-ацетона (40:10:1) удаляют каротин, который движется вместе с фронтом растворителя.
4.Щоб выделить ксантофиллы используют смесь бензин-ацетон-хлороформ (5:5:4).
5.Застосовуючы смесь растворителей, которая состоит из петролейного эфира и этанола (20:1) можно отделить неоксантин от других пигментов.
После того, как пигменты четко отделили друг от друга, полученную хроматограмму вынимают из хроматографической камеры, высушивают и разрезают ее на полоски в соответствии с положением каждого пигмента. Далее полоски с соответствующими пигментами нарезают мелкими кусочками, размещают в маленьких стаканах и заливают небольшим количеством спирта с ацетоном (1:3). Окрашенный раствор сливают в мерную сосуды и отмечают объем. После получения экстракта каждого пигмента определяют его оптическую плотность на спектрофотометре.
5. Измерение оптической плотности экстрактов спектрофотометрическим методом. Спектрофотометрический метод определения пигментов базируется на измерении оптической плотности растворов (D) пигментов в области спектрального максимума поглощения света. Оптическая плотность характеризует ослабление излучения в слоях различных веществ.
D = lg Io / I,
где Io – интенсивность излучения падающего луча на поглощающий раствор, I – интенсивность излучения, прошедшего через раствор луча.
Цель работы. Изучение качественного состава и количественного содержания пластидних пигментов методами хроматографии и спектрофотометрии.
Материалы и оборудование: исследовательские водные растения разных экологических групп; спектрофотометр, хроматографические камеры, аналитические и торсионные весы, пластинки “Silufol”, ступки, фильтр Шотта, колба Бунзена, электронасос, микропипетки, сверло; растворители (петролейный эфир, бензол, этанол, метанол, ацетон, гексан, бензин, бензол, хлороформ).
Ход работы. Навеску растительного материала (0,3 – 0,5 г) хорошо растирают в ступке с небольшим количеством растворителя (96% этанола или 80% – ацетона) до однородной массы. Растертую гомогенную массу количественно переносят в фильтра Шотта, смывая ступку и пестик небольшими порциями растворителя. Фильтруют под вакуумом, доводя фильтрат до определенного объема (10 мл).
Полученный экстракт смеси пластидних пигментов используют для количественного определения некоторых из них (хлорофиллов а, в, суммы каротиноидов) с помощью спектрофотометра и хроматографического разделения на компоненты.
На спектрофотометре определяют оптическую плотность раствора (D) по определенной длиной волны соответствующей максимумам поглощения исследуемых пигментов.
Макимумы поглощения для 80%-го ацетона и 96%-го этанола равны:
Хлорофилл а -665 нм,
Хлорофилл в -649 нм,
Каротиноиды -440 нм.
Количественное содержание пигментов (мг / мл) после спектрофотометрии рассчитывают по формулам:
Са = 11,63 Da – 2,39 D в,
Св = 20,11 D в -5,18 Dа,
Ca + в = 6,45 Da + 17,72 Dв,
С кар. = 4,695 Dкар. – 0,268 Са + в.
Далее рассчитывают содержание пигментов на грамм сырой или сухого вещества.
где А – содержание пигмента, мг / г;
С – концентрация пигмента, мг / л;
V-объем вытяжки пигмента, мл;
Р-навеска растительного материала, мг.
Делают выводы.
Хроматографирования проводят на пластинках “Silufol”, на которые с помощью микропипеток постепенно (постоянно подсушивая теплым воздухом) наносят 0,05-0,2 мл экстракта в виде небольших пятен или полос на расстоянии 2 см от нижнего края. Для сравнения на одну пластинку наносят несколько экстрактов из различных видов водорослей, но не более пяти. Делают две пластинки с одинаковыми вариантами.
Готовят растворители для хроматографии:
1.Чистий петролейный эфир.
2.Бензол с петролейным эфиром (1:3).
3.Петролейний эфир с этанолом (20:1).
Одну из двух пластинок помещают в камеру на дне уже налит растворитель № 1 и накрывают стеклом с целью герметизации. Петролейный эфир отделяет каротин. Когда желтая полоса фронта растворителя дойдет до верхнего края пластинки, ее вынимают, подсушивают и помещают в камеру с растворителем № 2.
Вторую пластинку помещают в банку с растворителем № 3.
То же делают и с другими растворителями.
Когда фронт растворителя дойдет до верхнего края, пластинки вынимают, подсушивают и анализируют хроматограммы, отмечая последовательность и цвет пятен.
Делают выводы.
(No Ratings Yet)
Загрузка...