Оценка изменений в прижизненном окраске клеток высших водных растений в ответ на действие модельных токсикантов

Большинство клеток лишены удобных функций, легко регистрируются под микроскопом, по которым можно было бы судить о состоянии их жизнедеятельности и о повреждении в его начальной оборотной фазе. Одной из таких функций является способность неповрежденных живых клеток откладывать в виде гранул многие вещества, как те, что производятся в самой клетке, так и те, что проникают в нее извне. К таким веществам относятся, например, некоторые прижизненные красители (нейтральный красный, малахитовый зеленый, метиленовый синий и др.).. Среди них особой универсальностью и удобством применения характеризуется нейтральный красный, который относится к слабых оснований. Красители, проникли в цитоплазму клетки, сначала расположенные в ней диффузно, а затем клетка конденсирует их в области аппарата Гольджи в виде гранул. Такие красители называют гранулярными. Гранулы нейтрального красного и диффузный распределение его хорошо видно под обычным световым микроскопом. По мере накопления красителя количество и размеры гранул увеличиваются, и они, выходя за пределы зоны аппарата Гольджи, распространяются по всей цитоплазме.

Откладывать гранулы способны только здоровые, полноценные клетки. Нарастание негативного воздействия любой природы подавляет эту функцию, вплоть до полного прекращения ее. Вместо гранулярного отложения в поврежденной клетке краситель диффузно окрашивает цитоплазму и ядро. Полное подавление гранулообразования и интенсивное диффузное окраски протоплазмы при действии некоторых агентов обнаруживают еще на обратной фазе повреждения, и, после устранения действующего агента в клетке восстанавливается нормальное грануловидкладання, а диффузно-окрашенная протоплазма обесцвечивается. Способность к гранулообразования может парализовать токсическое действие самих красителей, если их используют в очень высоких концентрациях.

Основные красители при рН близком к нейтральному, как правило, содержатся в клеточной вакуоли. В зависимости от состава вакуолярного сока, вакуоль окрашивается диффузно или происходит обособление красителя и образования в ней интенсивно окрашенных капель коацервата или кистей гранул различной формы и калибра; иногда образуются кристаллы красителя. Очевидно, что в растительных клетках сегрегация веществ в вакуоли защищает протоплазму от токсического действия их, так как при связке в гранулы снижается концентрация веществ, которые могут нанести вред клетке.

Механизмы взаимодействия поздравительных красителей и клетки сегодня интенсивно изучают. Значительным успехом исследований этого плана стала идентификация цитоплазматических органоидов, которые отвечают за процессы накопления поздравительное красителя в гранулах. В последнее время доказано, что гранулы, которые наблюдают под микроскопом, является не чем иным, как лизосомами, что аккумулировали краситель. Известно, что значение лизосом в развитии любой клеточной патологии большое и разнообразное, что даже трудно отыскать патологический процесс, в котором бы лизосомальных аппарат не брал бы активного участия. Установлен, также, универсальный характер участия лизосом при деструкции любого вещества, проникающего в клетки. Это свойство лизосом усиливает неспецифичность метода поздравительное окраски, который, по сути, является методом визуализации лизосом.

Несмотря на то, что метод микроскопии прижизненно окрашенных клеток не имеет простого количественного выражения результатов наблюдения и это препятствует его использованию в качестве самостоятельного маркера при мониторинговых исследований, его уместно использовать как дополнительный с другими цитоекологичнимы методами.

Материалы и оборудование. Водные растения (валиснерия, элодея и наяда); бихромат калия, приветственный краситель – 0,01% нейтральный красный; световой микроскоп, стаканы на 100 мл, предметные и накрывные стекла, пипетки на 10 мл, мерные колбы на 100 мл.

Ход работы. Готовят серию концентраций модельного токсиканта-K2Cr2O7. Опытные растения (валиснерия, элодея и наяда) помещают в стеклянные емкости объемом 100-200 мл и экспонируют их в растворах модельных токсикантов в течение 1 час. После окончания экспозиции часть листа из опытных растений переносят в раствор красителя (0,1% раствор нейтрального красного), в котором их выдерживают еще 1 час. Из окрашенных растений готовят временные препараты и под световым микроскопом проводят наблюдения. У растений элодея и наяды используют верхушечные побеги, в валиснерия – часть растения у основания, где размещены молодые клетки. Вторую часть растения переносят в емкости с чистой водой и экспонируют их еще 1 час для выяснения концентраций токсиканта при которых возможно восстановление способности клеток к гранулообразования. После экспозиции из них так же готовят временные препараты.

Оценивают степень отделения красителя в клетках исследуемых растений:

отсутствие гранулообразования (диффузное окрашивание) – (-);

слабое (единичные гранулы) – (+);

среднее (небольшие кисти на фоне единичных гранул) – (+ +);

интенсивное (большие гроздья гранул) – (+ + +);

и степень окраски:

отсутствие окраски – 0;

слабое (светло-розовое) – 1;

среднее (интенсивно-розовый) – 2;

интенсивное (ярко малиновое) – 3.

Результаты записывают в таблицу:

Вид растения / концентрация токсиканта, мг / л Растения после экспозиции в растворах токсикантов Растения из растворов токсиканта после экспозиции в чистой воде

Делают выводы относительно обратного и необратимого повреждения клеток различными концентрациями модельного токсиканта.

Теги: биомасса, болотные растения, водная растительность, водные растения, лабораторная работа, наука о расстениях, растения, строение растений