Культивирование водных растений из семьи рясковых

Подбор минеральных питательных сред для культивирования водных растений с целью их дальнейшего использования в токсикологических экспериментах важно как для получения нужной биомассы, так и для поддержания культуры в течение определенного периода. Водные растения преимущественно культивируют в аквариумах на жидких питательных средах, но иногда используют и твердые агаризовани среды.

В последние десятилетия ряски рассматривают как чрезвычайно ценный экспериментальный объект для лабораторных исследований многих физиологических процессов благодаря малым размерам, быстрому росту, относительно простой строении, преобладанию вегетативного размножения, неприхотливости к среде и, связанной с этим, легкостью выращивания в стерильных и водных культурах.

Размножают ряски преимущественно вегетативным путем. В благоприятных условиях вегетативные побеги очень быстро образуют новые листеци, причем как прирост плоскости, так и прирост количества листецив происходит типичным классическим способом. Как водоросли, имеют преимущество в том, что их можно выращивать в лабораторных условиях на синтетическом питательной среде с использованием света и тепла определенной интенсивности.

Обеспечение оптимальных условий для лабораторного выращивания рясок делает исследование независимыми от вегетационного сезона в естественных условиях и позволяет проводить исследования в течение года.

Цель работы: Ознакомиться с методами культивирования рясок, приготовить минеральные питательные среды для выращивания этих растений.

Материалы и оборудование: растения семейства рясковых (ряска малая, ряска триборозенчаста, вольфия бескорневая, багатокоринник); кристаллизаторы, автоклав, термостат, микробиологическая петля; дистиллят, 0,1%-ный раствор сулемы, 50%-ный спирт этанол, 0,05%-ный NaOCl, 1%-ный раствор сахарозы, 0,01%-ный аспарагин, цитрат железу, 1,5%-ный агар, KNO3, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, MnCl2, H3BO3, NH4NO3, K2HPO4, Fe2Cl6, FeCl3, CaNO3, KCl.

Ход работы. Материал собран в естественных условиях подлежит стерилизации с целью получения чистых культур, свободных от микроорганизмов. Стерилизацию проводят путем погружения растений в 0,1%-ный раствор сулемы и 50%-ный раствор спирта в течение 30-60 сек, или в растворе 0,05% NaOCl в течение 60 сек.

Затем растения промывают стерильной дистиллированной водой и переносят в сосуды со стерильным питательной средой с добавлением 1% сахарозы и 0,01% аспарагина. Эти операции выполняют в асептических условиях, в специальных камерах для прививки. Через несколько дней выращивания в термостате (освещение -1200 Люкс, температура-28о С) с гибнущих материнских листецив регенерируют наследственные листеци, которые дают начало стерильной культуре. Новые полученные растения можно пересадить на свежий питательную среду уже без дополнительной стерилизации и непосредственно использовать в исследованиях.

Приготовление жидких питательных сред. Различные виды семьи рясковых (ряска малая, ряска триборозенчаста, багатокоринник, вольфия бескорневая и др.). Можно вырастить на различных минеральных питательных средах с преобладающим содержанием известняка. Стерильные культуры хорошо растут на чисто минеральных смесях, однако добавление сахарозы значительно ускоряет рост. Важной составляющей успешного культивирования водных растений является правильный подбор солевого состава среды. Чаще всего используют такие среды:

Среда Гапоненко-Стражецького:

KNO3 – 0,4 г / л,

KH2PO4 – 0,2 г / л,

MgSO4 7 H2O – 0,3 г / л,

CaCl2 6H2O – 0,6 г / л,

MnCl2 4H2O – 0,3 мг / л,

H3BO3 – 0,5 мг / л,

Цитрат железу – 5 мг / л.

 

Среда Бенеке:

NH4NO3 – 0,2 г / л,

CaCl2 – 0,1 г / л,

K2HPO4 – 0,1 г / л,

MgSO4 0,1 г / л,

Fe2Cl6 – 1 капля 1% раствора.

 

Среда Бейеринка:

NH4NO3 – 0,05 г / л,

CaCl2 – 0,1 г / л,

K2HPO4 – 0,2 г / л,

MgSO4 -0,2 г / л,

FeCl3 – 1 капля 1% раствора.

 

Среда Кнопа:

CaNO3 – 0,25 г / л,

KH2PO4 – 0,06 г / л,

MgSO4 -0,06 г / л,

KCl – 0,08 г / л,

Fe2Cl6 – 1 капля 1% раствора.

 

Среда автоклавируют при 1,5 атм. в течение 20 минут.

Важным условием культивирования рясковых является правильное подбора освещения. Оптимальный интервал – 7-14 тыс. лк. Желательно непрерывное освещение, исключением является ряска триборозенчаста, лучший прирост которой наблюдается при 12-ти часовом освещении с интенсивнисю 1000 лк. Оптимальная температура выращивания равна 22-37 оС, минимальная 4-18 оС. Толерантным по температуре является багатокоринник (может выдерживать даже температуру 50 ° С в течение суток и 4 ° С в течение двух недель). Роста рясковых способствует нейтральная или слабощелочная реакция среды. В естественных водоемах ряска лучше растет при рН 6,9-7,2, однако культивирования в лабораторных условиях с этого уровня рН приводит к развитию сине-зеленых водорослей. Предыдущая стерилизация листецив ряски 70о-м этиловым спиртом (в течение 2-3 сек.) С последующим промыванием стерильной водой и культивирования по рН 6,3 препятствуют развитию сине-зеленых водорослей.

Приготовление твердого агаризованной среды. Для приготовления твердой среды используют 1,5%-й агар, который готовят на минеральной среде (1/20 от полного). Автоклавируют течение 30 минут при 1 атм. Затем агар разливают на косяки. Ряску сажают обычным способом с помощью микробиологической петли. Поддержание культуры ряски на косяках не приводит сложностей, поскольку пересаживают ее раз в 2-3 месяца. Косяки хорошо сохраняются при комнатной температуре на рассеянном свете. Метод выращивания рясок на агаризованому среде можно использовать для получения безбактериальнои культуры, поскольку регулярное пересадки (через 2-3 недели) способствует освобождению ряски от сопутствующих бактерий и водорослей. Выращивание рясковых на твердой среде позволяет сохранять собранные образцы в течение долгого срока.